肺炎支原体感染对肺上皮细胞自噬的影响开题报告
肺 炎 支 原 体 （Mycoplasma Pneumoniae，MP）是介于细菌和病毒之间的一类无细胞壁的原核细胞型生物，是引起呼吸道感染的常见病原体。肺炎支原体感染主要见于儿童和青少年，但我国近年来成年人的致病率也有上升趋势。肺炎支原体感染患者临床症状缺乏特异性，体征不典型，严重者可产生肺外合并症，容易造成漏诊及误诊，从而延误诊治。根据流行病学显示，目前肺炎支原体已成为我国成人社区获得性肺炎（GAP）的主要致病源之一，甚 至 超 过肺炎链球菌感染，已经成为成人GAP首要致病源。由于近年来抗菌药物在临床的不合理使用，ＭＰ对一些常用抗菌药物已产生一定耐药性，并且国内外均分离出肺炎支原体耐药菌株，给临床治疗带来很大困难。而且，临床上呼吸道常见的比如慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、支气管扩张、胸腔积液等疾病均可合并支原体感染，更有证据表明肺炎支原体感染会增加哮喘的发病以及形成难治性哮喘的可能。因此，为了提高下呼吸道肺炎支原体感染患者的抗菌药物使用准确率及减少耐药性，我们通过对ＭＰ的培养研究，为肺炎支原体感染对肺上皮细胞自噬的影响，提供参考依据【1】。
肺炎支原体的培养：将无菌棉拭于患者喉深部（最好扁桃体发炎部位）捻转数次，放入无菌管内立即送检。
检验方法：将培养液及药敏试验板在接种样本前接近室温，用移液枪吸取100ul培养液加入对照孔；接种咽拭子标本在剩余的培养液中，加盖摇匀使之混匀；在其余的微孔中每孔加入100ul含样本的培养液，轻轻震荡药敏试验板；在所有微孔滴加１滴试剂盒所附矿物油；将药敏试验板加盖后放入37℃培养箱，培养24～48ｈ观察结果。
结果（１）MP生长：经培养后培养液由桔红色变成黄色，用（＋）表示。（２）ＭＰ未生长：经培养后培养液未变色，用（－）表示。（３）药敏试验板抗菌药物结果判定：依托红霉素（EST）孔培养液桔红提示为敏感（Ｓ），黄色为耐药（Ｒ）；剩余13种抗菌药物药敏试验板上下两孔均为桔红色为敏感（Ｓ），均为黄色为耐药（Ｒ），上孔黄色而下孔是桔红色则为中介（Ｉ）。经过培养后在显微镜下可以见到荷包蛋样菌落,并进行菌落计数确定了大概含量为左右【2】。
肺上皮细胞的培养
取实验室液氮冻存的小鼠肺上皮细胞MLE-12 细胞株，于37 ℃ 水浴中快速溶解水后，1000 rpm，离心 5 min，弃上层冻存液，加入含 10% 胎牛血清的 1640完全培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养。待细胞密度达80% ～90% 后，加入 0. 25% 胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，计数，按实验分组铺板，各组分别加入相应的药物处理48 h。
用荧光染料对组织切片或细胞进行染色观察自噬的发生。晚期自噬体与溶酶体融合而呈酸性，根据这个特点可用酸向性染料MDC、吖啶橙和Lyso Tracker标记自噬溶酶体。
吖啶橙(AO)染色方法：吖啶橙是检测酸性囊泡结构的重要弱碱性染色剂。AO具有细胞渗透性可以自由地跨膜，染色DNA和胞质为亮绿色。AO也可以渗透进入酸性细胞器(例如自噬溶酶体)，对pH敏感，当pH值较低的时候，AO以质子化形式积聚在酸性部位并发出红色荧光。红色荧光的强度反映了细胞酸性成分的酸度。将吖啶橙溶液直接加入细胞中孵育15分钟，经PBS清洗后，可立即在荧光显微镜下观察红色荧光的强度，也可以直接用流式细胞仪进行定量分析【3】。
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