开题报告内容：
一、研究目的与意义
细胞色素P450 3A4酶（简称CYP3A4）在人类药物代谢酶中是最主要的异构酶，在肝脏CYP酶总量中约有40%是CYP3A4，此酶在肠道中也大量表达。 CYP3A4具有广泛的代谢底物谱，临床上使用的药物大约有50%可由CYP3A4代谢[1]。大部分药物经过CYP3A4的纯化作用，或直接或有利于促进了药物从机体的排泄作用。同样许多药品经由CYP3A4活化而形成其活性成分，而许多原毒素也由此成为其毒性形式。所以CYP3A4可以应用于代谢酶途径和药物代谢的研究，药物与药物的相互作用以及评价候选药物的抑制诱导效应等，此外还可以应用于癌症的基因治疗，加强药物的疗效降低不良反应等。在传统的基因工程技术中，原核表达系统是常被研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完善等缺陷。随着分子生物学和重组技术的快速发展， P450 3A4基因被精细操作并已经成功在异源系统中表达[2]。到目前为止，常用的异源表达系统有大肠杆菌、昆虫细胞、酵母细胞以及哺乳动物细胞表达系统。而哺乳动物细胞体内含有CYPs活性发挥所必须的辅酶CPR及细胞色素b5等，因而越来越多的应用于CYPs的表达。HepG2细胞来源于人体肝脏，保留了许多异生代谢活性，因此，其常常用于人体毒性、致癌性以及细胞诱变性试验的预测。并且研究发现，HepG2细胞含有CYP450酶催化反应所需的NADPH细胞色素P450还原酶和细胞色素b5存在。所以基于基因表达技术的真核表达系统的构建对体外表达CYP3A4酶并对其活性进行研究对CYP3A4基因多态性的临床作用有着重要意义。
二、国内外研究现状
对于细胞色素P450的研究，最早从20世纪50年代就已经开始。到1958年，已经可以从大鼠的肝微粒中分离到第一个P450蛋白。在20世纪70年代，有研究证明了P450酶系在致癌物代谢中的功能。直至20世纪80年代，研究者开始应用分子生物学技术克隆出P450基因。十余年后，科学家在异源表达系统中表达出纯的P450，这表示得到的P450单纯酶和与其相互作用的酶可建立起体外药物筛选体系，进行体外代谢数据和性质的研究，然后再研究体外代谢数据和性质到体内相关数据的预测，是体外药物代谢研究中的一个重要方面，而这一领域的研究恰恰是现代体外药物代谢研究区别于传统的药物代谢研究的一个关键点。到目前为止，经常被使用的异源表达系统有大肠杆菌、昆虫细胞、酵母细胞以及哺乳动物细胞表达系统。在细胞色素P450家族中，CYP3A4作为一种重要的P450系氧化代谢酶参与近50％临床药物的代谢。目前，在CYP3A4基因中发现了近30种单核苷酸多态性其突变等位基因从CYP3A4*2Z至CYP3A4*19。
三、研究方法和手段
1、实验思路：将目的基因通过PCR方法扩增并引入酶切位点和保护碱基，经TA克隆后转化感受态细胞DH5a，蓝白斑双重筛选阳性克隆，挑取阳性克隆接种入液体LB培养基使其大量扩增（37℃培养12h），进行小提质粒并测序检测序列正确性。酶切序列正确的阳性克隆及空表达载体，酶联目的基因与表达载体，以含卡那霉素的LB培养基筛选阳性克隆，挑取阳性克隆接种入液体LB培养基使其大量扩增（37℃培养12h），进行大提质粒并测序检测序列正确性。将以构建好的表达载体通过脂质体法转入HepG2细胞中，实现在真核细胞中的表达。
2、实验中要用到的方法：验证目的基因是否成功连接到克隆载体上，用半乳糖苷酶蓝白斑筛选法。小提质粒用质粒小提试剂盒。验证酶切结果用DNA琼脂糖凝胶电泳，电泳后回收DNA用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型），将表达载体导入HepG2细胞中用脂质体法。
四、文献综述
细胞色素P450酶，别名为混合功能氧化酶和单加氧酶，是肝脏中主要的药物代谢Ⅰ相
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