开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、拟研究的问题：
探究抗人DR5单链抗体在大肠杆菌中的表达及分离纯化步骤及其优化，获得比较纯正的DR5单链抗体。本实验采用PCR获取鼠源性抗人DR5单链抗体重链和轻链可变区基因序列，以一柔性连接肽连接二者，转入大肠杆菌中，以大肠杆菌表达融合蛋白，[10]用western blotting检测表达情况，亲和色谱纯化后鉴定单链抗体免疫活性。探究表达纯化后的重组蛋白具有接近完整抗体的肿瘤细胞凋亡诱导活性，DR5 scFv 是否可作为诱导肿瘤细胞凋亡的候选药物为肿瘤免疫学研究提供材料。
二、研究背景介绍
癌症在我国已成为威胁人类生命的元凶，发病率呈上升趋势，人们一直在寻找肿瘤治疗的良方。近些年来，自从观察到细胞发生凋亡的现象以后，人们认识到肿瘤的发生不仅是正常细胞的过度增生和分化异常，而且机体对肿瘤监视机制缺失导致肿瘤细胞的凋亡不足也会导致肿瘤的发生。所以人们从寻找诱导引起肿瘤细胞凋亡或者克服肿瘤细胞对凋亡耐受的角度入手，达到治愈肿瘤的目的[1]。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，简称 TRAIL，是能够诱导细胞凋亡的肿瘤坏死因子超家族的成员。研究发现 TRAIL 具有广谱抗癌作用，对大多数来源于人类肿瘤的癌细胞系均有一定的杀灭作用。包括来自于直肠、肺、乳腺、肾、前列腺、胰腺、恶性神经胶质瘤、皮肤、恶性淋巴瘤脑、结肠癌及血液系统的肿瘤细胞等，对于在裸鼠中建立的移植性肿瘤也显示出良好的敏感性，如结肠癌、乳腺癌等，都可以引起肿瘤消退或抑制生长[2,3]
死亡受体 5 (death receptor 5, DR5) 是 TRAIL 受体之一,属于I型跨膜蛋白，肿瘤坏死因子受体超家族成员，它由411个氨基酸残基构成，其中信号肽序列较大，含有51个氨基酸残基，胞外区为132个氨基酸残基，跨膜域含有22个氨基酸残基，胞浆结构域为206个氨基酸残基，也存在2个富含半胱氨酸的基序。目前现有的研 究证实，抗 DR5 单克隆抗体(mAb)可通过与 DR5 的特异性结合，诱导表达 DR5 的肿瘤细胞凋亡。其机制是激活外源性膜受体，继而启动细胞线粒体途径导致细胞凋亡。[4]
TRAIL 可以用于对放化疗产生耐受的肿瘤细胞的治疗。[5-9]DR5 与 TRAIL 结合后，能选择性地杀伤多种肿瘤细胞而对正常细胞没有毒性。所以人们在细胞凋亡研究领域中主要是有三种方向：①可溶性重组 TRAIL 的应用，②制备能诱导凋亡的抗 DR5 或 DR4 的抗体，③使用能促进内源性 TRAIL 的表达[11,12]
三研究现状与问题
单克隆抗体在临床上也有很大限制，如完整的抗体相对分子质量大，而且大部分抗体是鼠源性抗体，应用于人体容易诱发人体产生人抗鼠抗体反应 HAMA，阻断抗体效用的发挥，妨碍了其在临床上的应用[13]。随着 DNA 重组技术的发展，可以应用基因工程 技术制备基因工程抗体，既能保持单克隆抗体均一性，特异性强的优点，又能克服其鼠源性的弊端。噬菌体抗体库技术是抗体库领域的最重要进展，它推动了抗体基因组文库的发展。用重组 DR5抗原免疫小鼠，建立了抗 DR5 单链抗体噬菌体库，经过5轮筛选，获得亲和力较高的抗 DR5 单链抗体。得到的抗DR5单链抗体具有对肿瘤细胞的致凋亡作用[15].
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