开题报告内容：
高胆固醇血症是人体内的脂肪代谢紊乱引起的一种或几种脂质水平高于正常范围的一种疾病。一般来说，高胆固醇血症是由于摄入过量富含胆固醇、饱和脂肪的食物引起的，还有一部分人的高胆固醇血症是基因缺陷导致的先天性高胆固醇血症，即家族性高胆固醇血症(Familial hypercholesterolemia, FH)。FH 是一种常见的非常严重的遗传性脂代谢遗传性疾病，能够导致低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）水平的升高及动脉粥样硬化提前[1]。
目前比较看好的降血脂治疗方式为 PCSK9 抑制剂与他汀类药物联合治疗的疗法。PCSK9 抑制剂主要包括：（1）采用单克隆抗体或模拟肽抑制 PCSK9 与 LDLR 的相互作用；（2）采用基因沉默试剂如反义寡核苷酸、小分子干扰 RNA 等抑制 PCSK9 的合成；（3）采用小分子药物抑制 PCSK9 蛋白的自催化裂解等[2]。
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因属于前蛋白转化酶(PC)家族,由信号肽、前结构域、催化结构域和羧基末端结构域组成。大量研究发现,PCSK9能介导低密度脂蛋白受体(LDLR)降解,调节血浆LDL胆固醇(LDL-C)水平;而PCSK9的两类主要突变,功能获得型、功能缺失型可分别导致高胆固醇血症和低胆固醇血症.因而研究PCSK9对相关心血管疾病的防治有重要意义。[3]
人类PCSK9基因定位于染色体1p32.3,长约22kb,由信号肽、前结构域、催化结构域和羧基末端结构域(V结构域)顺次连接而成,所编码酸性糖蛋白各区域氨基酸序号分别为1～ 30、31～ 152、153～452、453～ 692[4]。PCSK9蛋白合成分泌与其他前蛋白转化酶相似,内质网中合成PCSK9酶原(apo-PCSK9,74 kD),apo-PCSK9于内质网或高尔基体中发生自身催化反应,在SVFAQuarr;152处裂解释放前肽(14 kD)形成成熟蛋白酶(60 kD)并分泌入血。PCSK9主要在肝脏、肠道表达,在肾脏、皮肤、脑中只有少量表达[5]。
YAMAMOTO 等[6]的研究表明 PCSK9 末端结构域在降解 LDLR 的过程中起到关键作用，然而，该结构域的具体作用却未可知，目前提出的两种假设分别是：（1）该结构域与 LDLR 上的配体结合域在内涵体发生作用[7]；（2）该结构域与细胞膜表面的淀粉样蛋白前体蛋白 2 (amyloid precursor-like protein 2，APLP-2)结合[8]。因此，应用与天然人类 PCSK9 蛋白在结构和修饰上相同的重组蛋白是研制高效、特异、无副作用的 PCSK9抑制剂的基础。
目前主要有通过体外建立稳定的表达细胞系[9]和利用杆状病毒表达系统[10]来生产制备 PCSK9 重组蛋白的方法，这些方法存在实验周期长、蛋白表达量低和难以获得高表达细胞株等缺点。CHO 细胞表达系统是目前商业上用于疾病治疗的最常用的重组蛋白表达系统[11]，CHO 细胞具有稳定、高效、高表达重组蛋白的能力，且表达的蛋白具有准确地翻译后修饰，具有蛋白活性，目前已成功应用于大规模发酵，最高可达 10000 L。
本课题旨在建立体外大量制备在结构和功能上与天然人 PCSK9 相似的重组蛋白，建立在实验室快速生产制备毫克量级重组人 PCSK9 蛋白的方法，为进一步深入研究 PCSK9 结构、功能、制备新的特异性 PCSK9 抑制剂和特异单克隆抗体奠定基础。本课题省略了质粒的构建，着重于蛋白的表达与分离纯化。
PCSK9蛋白表达实验初步流程设计如下：
质粒的准备→悬浮 CHO-s细胞培养→细胞转染→蛋白的收集→Western Blotting检测
以上是毕业论文开题文献，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
