一．研究背景
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是胰岛素分泌不足，以高血糖、高血脂为特征的代谢紊乱综合征。糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是继发于糖尿病的最常见的心血管并发症之一。由高血糖导致代谢障碍、氧化应激，激活炎症反应，导致心肌组织胶原沉淀、心肌重构，造成左心室结构的异常，心肌纤维化、血管周围的间质纤维化等。因此，DCM患者心肌纤维化可导致患者左心室收缩和舒张功能障碍，伴随病程发展，导致不可逆的心力衰竭，成为糖尿病患者死亡的重要原因之一。
瞬时受体电位（transient receptor potential ，TRP）通道是一种与神经生物学有关的基因，其家族成员瞬时受体电位M型7（TRPM7）是最具有代表性的双功能膜蛋白。TRPM7通道是第一个被发现同时具有通道功能和激酶功能的离子通道[1]，因此被称为“通道酶”。其广泛表达于机体的多种组织器官中，参与众多生理病理过程，包括钙超载，缺血/缺氧神经元损伤，调节细胞内Mg2 平衡、介导微量金属元素进入细胞、参与神经递质的释放、细胞运动 等[2-4]。研究表明[5]，TRPM7与细胞纤维化的形成有关，CHF大鼠心肌组织TRPM7表达明显增加，并与心肌纤维化程度呈正相关 。
二、研究方案与方法
- 乳大鼠心纤维细胞的原代培养。
取出生不超过48h的乳大鼠于超净台外浸泡75%酒精消毒后，在超净台中剪开胸腔，弯镊钩取心脏，将取出的心脏放置于低温的D-Hanks溶液中轻轻挤压清洗。将清洗完成的心脏置于烧杯中，加入适量消化酶液，在酶液中将心脏组织剪碎成1mm3左右大小碎片。吸弃上清，重新加入适量酶液，转移至血清瓶中，于37℃水浴消化，并不断轻轻摇晃。弃去第一次消化的上清，重复步骤，直至心脏组织块消失。收集第2次至最后一次所有上清，分次加入完全培养基中终止消化。离心后，弃上清，收集所有消化后的沉淀。加入低糖完全培养基重悬制为细胞悬液，200目筛网过滤至培养皿中，放入培养箱（5% CO2，37℃）中培养。利用差速贴壁法分离心肌成纤维细胞和心肌细胞。低糖环境于培养箱中培养1.5h后取出培养皿，轻轻晃动，将细胞悬液转移至离心管中，离心1000r/10min。培养皿中加入2mlPBS清洗，两次，弃去PBS。加入低糖完全培养基，该细胞为已贴壁的心肌成纤维细胞，置于培养箱中正常培养。弃去离心管上清，加入高糖完全培养基重新混悬，200目筛网过滤至培养皿中，该细胞为心肌细胞，置于培养箱中正常培养，6-8h后可贴壁，即可用于实验。
- 高糖致心肌纤维化模型的建立及分组。
心纤维细胞在对照组血糖浓度(5.5mmol/L)培养基中培养2,3天后，选取贴壁细胞密度在80％-90％以上的细胞用于实验。
用高糖(25mmol/L)培养基干预心肌细胞作为高糖组。
用高糖培养基加NF-kappa;B激动剂干预心肌细胞作为高糖NF-kappa;B激活组。
在高糖培养基加NF-kappa;B激动剂培养后，在传代细胞培养基中再加入新化合物大精酸来干预培养心肌细胞作为治疗组。
进行后续实验。
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