汉黄芩苷抑制结肠癌上皮间质转化的作用研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

背景与目的

黄芩是唇形科植物黄芩(ScutellariaBaicalensisGeorgi)的干燥根, 最早收载于《神农本草经》, 为中品。黄芩性味苦寒，具有清热燥湿, 泻火解毒, 止血安胎的功效。汉黄芩苷是黄芩中的主要黄酮类成分,现代研究表明其具有广泛的药理作用, 如抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、心血管保护和神经保护作用。本实验对黄芩提取物中有效成分汉黄芩苷对结肠癌细胞上皮间质转化和侵袭转移的抑制作用进行研究, 以期对汉黄芩苷中药制剂的临床使用有所启示。

结肠癌是我国最常见恶性肿瘤之一。近年来,发病率和死亡率呈上升趋势。结肠癌的预后与其是否发生转移有关, 绝大部分患者最终死于肿瘤转移。然而目前用于预测包括结肠癌在内的恶性肿瘤侵袭转移的临床指标尚未明确。研究发现,肿瘤侵袭转移的关键是肿瘤细胞获得侵袭性,并从原发灶逃离,而上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在此过程中发挥了重要的作用。EMT是指上皮细胞失去了细胞极性及细胞间紧密连接,形成具有迁移能力的纺锤形间充质细胞。EMT与恶性肿瘤的侵袭转移密切相关。

核转录因子-kappa;B(nuclear factor-kappa B,NF-kappa;B)是一种多功能的核转录因子,其不仅可以调控机体的多种生理病理反应，还对肿瘤的发生发展、侵袭转移起着重要作用。大量研究表明,NF-kappa;B的持续活化是肿瘤恶性转化的一个关键点。

已有研究表明，汉黄芩苷具有抑制NF-kappa;B信号通路的作用，进而抑制EMT的进程。本课题先通过探究汉黄芩苷对NF-kappa;B通路的影响，进而通过调控NF-kappa;B的活性, 观察NF-kappa;B对结肠癌细胞株HCT116发生EMT及侵袭迁移能力的影响, 以期探讨NF-kappa;B与汉黄芩苷在结肠癌细胞EMT及侵袭转移中的作用。

研究手段

1.1细胞培养及干预实验

小鼠巨噬细胞[1]为由本室保存。用 DMEM培养基 （含 10 %胎牛血清、 100 UomL-1 青霉素和 100mu;gomL-1链霉素) 5 % CO2，37℃条件下传代培养。取生长状态良好的RAW264.7 细胞，0.25%胰酶消化，台盼蓝染色鉴定细胞活率ge;95%，用 DMEM 培养基调整细胞浓度为 1times;106/ml，每孔 1ml接种到 24 孔培养板内，待细胞生长至 80%融合后，加入不同浓度的黄芩苷（终浓度分别为 10,50,100mu;moloL-1 ）孵育 1h，然后加入 LPS （终浓度 1mu;gomL-1 ）进行刺激。实验分组如下：正常对照组、 黄芩苷组、 LPS 组和黄芩苷加 LPS 组。 根据实验要求在相应时间点取细胞或培养上清进行后继实验。

1.2细胞因子浓度测定
RAW264.7 细胞加入汉黄芩苷和 LPS 后继续培养 18h，收集各处理组细胞培养上清液，用 TNF-alpha; 和 IL-6Elisa 试剂盒检测上清液中细胞因子的含量。操作步骤按试剂盒说明书完成。

1.3核 NF-kappa;B p65 蛋白的检测

RAW264.7细胞加入刺激物后继续培 30min，以冰冷的PBS 终止刺激，用细胞刮子将细胞刮下,5000rpm 离心洗涤细胞 2 次，提取细胞核蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。取 50mu;g 样品煮沸变性后进行 SDS-PAGE 电泳（ 5%的浓缩胶和 10%的分离胶），转膜，5%的脱脂奶粉37℃封闭1h，加抗 NF-kappa;B p65或抗beta;-actin 单克隆抗体为一抗(1:1000)，4℃孵育过夜，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的相应二抗稀释液(1:2000) 37℃孵育 1 h，ECL 法显影，用图象分析系统分析目标带灰度值，以目的蛋白与内参 beta;- Actin 蛋白的灰度比值来表示目的蛋白的相对表达量。

2.1 细胞培养:

人结肠癌HCT116细胞株用含10%胎牛血清的培养液培养于5%CO2、37 ℃的细胞培养箱中,细胞在培养瓶中长满约90%时传代。传代时常规吸去培养液,PBS润洗3遍后用0.25%的胰蛋白酶消化,按所需细胞密度接种。

2.2 相差显微镜观察细胞形态

取对数生长期细胞, 消化后制成合适浓度的细胞悬液, 接种至六孔板, 贴壁后分别用20 ng/mL的TNF-alpha;和20mu;mol/L的PDTC干预4 d, 对照组加等量培养基,相差显微镜观察细胞形态变化并拍照。

2.3 细胞侵袭迁移试验

实验分3组, 分别为正常对照组、 TNF-alpha;(20 ng/mL)组和PDTC(20mu;mol/L)组, 干预4 d后, 胰蛋白酶消化细胞, 用无血清培养基重悬, 使细胞浓度调整为5times;105个/mL, 侵袭实验取200 mu;L细胞悬液种于铺好Matrigel胶的Transwell上室中, 下室加入600 mu;L含20%血清的培养基, 37 ℃孵育24 h,棉签擦去上室的非迁移细胞, 移出Transwell小室, 倒置风干, 甲醛固定30 min后用0.1%结晶紫染色15 min,PBS清洗,倒置风干,倒置相差显微镜下观察并拍照(times;200), 每个样片随机取4个视野拍照并计数侵袭细胞数,计算平均值, 以空白试剂为对照，分析数据。细胞迁移试验不需要铺胶, 其余操作均同侵袭实验。

2.4 Western blot法检测NF-kappa;B活性调节剂处理细胞后p65、P-p65、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达

各组细胞处理4 d后提取总蛋白,BCA法测蛋白浓度。各组取35 mu;g蛋白上样,按电泳、转膜、牛奶封闭后一抗4 ℃孵育过夜,室温孵育二抗1 h的流程进行操作,化学发光胶片曝光显影。图像分析仪行胶片扫描,分析灰度值。

附录

综述

汉黄芩苷抑制结肠癌上皮间质转化的作用研究

摘要

研究汉黄芩苷对人结肠癌细胞上皮间质转化的影响，并初步探讨其作用机制。通过细胞培养及干预实验、细胞因子浓度测定、核 NF-kappa;B p65 蛋白的检测等实验探究汉黄芩苷对NF-kappa;B信号通路的抑制作用。通过细胞侵袭迁移试验和Western blot法检测处理细胞后p65、P-p65、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达实验探究NF-kappa;B在EMT进程中起到的作用，进而研究汉黄芩苷对整个侵袭进程的影响[2]。

引言

结肠癌 （Colorectal cancer） 是最常见的消化道肿瘤之一，全球发病率、死亡率分别位于第 3 位和第 2 位 ，目前在我国结肠癌发病率占恶性肿瘤的第 2 位，并呈逐年上升趋势。结肠癌的治疗主要是采取根治性手术切除， 往往术后化疗治疗的作用十分有限且不良反应极大，因此，新药的研究就显得十分重要。结肠癌的预后与其是否发生转移有关, 绝大部分患者最终死于肿瘤转移。然[3]结肠癌在内的恶性肿瘤侵袭转移的临床指标尚未明确。研究发现,肿瘤侵袭转移的关键是肿瘤细胞获得侵袭性,并从原发灶逃离,而上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在此过程中发挥了重要的作用[2]。EMT是指上皮细胞失去了细胞极性及细胞间紧密连接,形成具有迁移能力的纺锤形间充质细胞。EMT与恶性肿瘤的侵袭转移密切相关。

正文

首先去探究汉黄芩苷对NF-kappa;B信号通路的影响。分别用 LPS （终浓度 1mu;gomL-1）和 LPS 汉黄芩苷（终浓度 10,50,100mu;mol moloL-1）处理生长良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7，用 RT-PCR 法和 Elisa 法检测细胞及其上清液中 TNF-alpha;、 IL-6 mRNA 和蛋白的表达变化，用 Western Blot 法检测细胞核内 NF-kappa;B p65 蛋白含量变化。结果：LPS 刺激 RAW264.7 细胞可导致 NF-kappa;B 激活，上调 TNF-alpha;、 IL-6 表达；汉黄芩苷预处理能降低LPS诱导的 NF-kappa;B 活化和 TNF-alpha;、IL-6 表达[4]。

其次，再去研究核转录因子-kappa;B(nuclear factorkappa B, NF-kappa;B)对人结肠癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)及侵袭和转移的影响。核转录因子-kappa;B(nuclear factor-kappa B, NF-kappa;B)是一种多功能的核转录因子[3], 其不仅可以调控机体的多种生理病理反应, 还对肿瘤的发生发展、侵袭转移起着重要作用大量研究表明, NF-kappa;B的持续活化是肿瘤恶性转化的一个关键点[5]。有研究报道, NF-kappa;B可促进转录因子Snail、 ZEB-1和ZEB-2的表达来抑制上皮特定基因E-cadherin 和桥粒斑蛋白的表达, 同时诱导间质特定基因Vimentin 的表达, 从而诱导EMT的发生. 在与单核细胞共培养的HK-2细胞中,NF-kappa;B信号通路被激活, 使ICAM-1表达上调, 进而诱导EMT。在胰腺癌细胞中, NF-kappa;B的活化也可以诱导EMT表型的发生。

参考文献

1. Wang, F., et al., Wogonin inhibits H2O2-induced vascular permeability through suppressing the phosphorylation of caveolin-1. Toxicology, 2013. 305: p. 10-19.

2. 黄芩苷对结肠癌细胞迁移与侵袭能力的抑制作用及其机制研究_吴汪泽

3. NF_kB对人结肠癌细胞上皮间质转化及侵袭转移的影响_刘宝玉

4. Liu, B.-Y., Role of NF-kappa;B in induction of epithelial-mesenchymal transition, migration and invasion of human colon cancer cells. World Chinese Journal of Digestology, 2014. 22(23): p. 3403.

5. Sun, Y., et al., Wogonoside protects against dextran sulfate sodium-induced experimental colitis in mice by inhibiting NF-kappaB and NLRP3 inflammasome activation. Biochem Pharmacol, 2015. 94(2): p. 142-54.