一、研究问题：黑曲霉次生代谢产物的化学结构及其药理活性。
二、研究手段：课题拟取黑曲霉标准菌株，在适宜环境下发酵，用超声破壁，有机溶剂萃取，柱色谱及薄层色谱等手段得到纯化合物，运用IR,NMR,MS等波谱技术分析化合物结构，并查阅相关文献全面深入地研究其生理活性。下图为简略实验流程：
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发酵培养黑曲霉标准菌株 过滤 |
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发酵液 |
菌丝体 |
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浓缩后柱色谱分离纯化 对单个化合物进行结构鉴定及药理活性测试 |
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三、文献综述：
黑曲霉次生代谢产物研究
摘要:黑曲霉，是FDA准许使用的食品工业用微生物的一种，安全性高，广泛用于工业发酵和异源蛋白表达载体，生产酶制剂和各种有机酸。近年开始有学者研究开发其代谢产物作为药物使用，但相关报道还较少。目前已知黑曲霉的次生代谢产物有抗肿瘤活性、可防治植物寄生线虫病害、对孢子类真菌有抑制作用、可用于处理金属矿石等。因此，还需要更多更深入的研究。
关键词:黑曲霉 次生代谢产物
Study on the secondary metabolites of Aspergillus niger
Abstract: Aspergillus niger is a food industry microorganism approved by the FDA. It has high safety and is widely used in industrial fermentation and heterologous protein expression vectors to produce enzyme preparations and various organic acids. In recent years, some scholars have started to research and develop their metabolites as medicines, but there are few reports about them. Currently known secondary metabolites of Aspergillus niger have antitumor activity, can prevent plant parasitic nematode diseases, have inhibitory effects on spore fungi, and can be used to treat metal ores. Therefore, more and more in-depth research is needed.
Key words: Aspergillus niger secondary metabolites
前言
黑曲霉(Aspergillus niger)，属于丛梗孢科（Hyphomycetales）曲霉属（Aspergillus）,一种腐生真菌，菌落表面呈黑色，显微镜下观察可见分生孢子梗有球形顶囊，小梗双层，顶囊上密布带有小球的梗和梗基[1]。
一． 黑曲霉的次生代谢产物化学成分研究概况
查阅整理相关资料，可总结出黑曲霉次生代谢产物的大概情况：
1.1萘并吡喃酮类：主要由1个萘环和1个吡喃酮环构成，是黑曲霉次生代谢产物的特征成分，一般具有抗菌和卤虫致死活性[2]。
表1黑曲霉中的部分萘并吡喃酮类化合物
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Aurasperone A |
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Aurasperone B[3] |
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Asperpyrones B |
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Asperpyrones C |
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Fonsecinone A |
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Rubrofusarin B |
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Flavasperone |
Figure 1Aurasperone A（左），Aurasperone B(右)
1.2鞘脂类化合物：分为神经酰胺类和糖鞘脂类化合物，是海洋来源黑曲霉中的重要成分，有抗真菌抗肿瘤抗病毒等生物活性[4-6]。
表2鞘脂类化合物
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Asperamide A |
(2S,2′R,3R,3′E,4E,8E)-N-(2′-hydroxy-3′-hexadecenoyl)-9-methyl-4,8-icosadien-1, 3-diol |
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Asperamide B |
1-O-beta;-D-glucopyranosyl-(2S,2′R,3R,3′E,4E,8E)-N-(2′-hydroxy-3′-hexadecenoyl)-9-methyl-4,8-icosadien-1,3-diol |
Figure 2Asperamide A
Figure 3Asperamide B
1.3麦角甾类[7]：这一类化合物有相似的骨架结构，部分不同的基团，有一定的抗肿瘤细胞增殖活性。
表3麦角甾类
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3beta;,15beta;-二羟基-( 22E,24R) -麦角甾-5,8( 14),22-三烯-7-酮（1） gymnasterone C（2） 5alpha;,8alpha;-过氧-( 22E,22R)-麦角甾-6,22-二烯-3beta;-醇（3） ( 22E,24R)-麦角甾-5,7,22-三烯-3beta;-醇（4） 麦角甾-5,8,22-三烯-3beta;-醇（5） |
Figure4化合物1 Figure 5化合物2
Figure6化合物3 Figure7化合物4
Figure 8化合物5
二． 黑曲霉的次生代谢产物作用
2.1防治植物线虫病害：植物寄生线虫是指能寄生于植物的各种组织，使植物发育不良，并且在感染寄主的同时会传播其它植物病原，造成植物出现疾病症状的一类线虫。被线虫侵染的番茄植株中可溶性蛋白和防御酶的含量会大大降低，由于可溶性蛋白大多是参与代谢的酶类，其含量降低会导致植株难以抵御其他病原物的侵害，对农业生产造成很大损失。而传统化学药物由于难代谢易残留和对人体的有极大伤害等原因，正在逐步淘汰，寻找新的药物迫在眉睫。黑曲霉可作为生防真菌用于防治植物寄生线虫病害。实验表明，黑曲霉的代谢产物对植物寄生线虫的卵、幼虫、成虫均有毒性，与对照相比，施用黑曲霉次生代谢产物的番茄植株，其根结线虫种群数量有明显降低，且同时有促进番茄的生长的效果。进行可溶性蛋白含量和酶活性的测定实验后，从实验数据可知，黑曲霉的代谢产物可以提高番茄可溶性蛋白含量和防御酶（PAL、PPO、POD、SOD、CAT）活性,从而一定程度上防治线虫[9]。
2.2对癌细胞有抑制活性：癌症的治疗是世界性的难题，2018年癌症患者人数预计新增1810万，死亡人数约有960万，发病率和致死率皆名列前茅。目前已知的抗肿瘤药物中，天然药物抗肿瘤效果好，毒副作用小，非常有研究价值。
从海洋真菌黑曲霉2HL-M-8中提取分离出其代谢产物，采用MTT法测定这些化合物对人肺腺癌细胞(A-549)、白血病细胞(HL-60)、人胃癌细胞(MGC-803)的体外抗细胞增殖活性，以紫杉醇为阳性对照，观察实验结果可知，化合物malformin A1, malformin A2对以上三种细胞株的有明显的体外抗增殖活性，但弱于紫杉醇; gymnasterone C对人胃癌细胞的体外抗增殖活性与紫杉醇相当[7]。从福建红树林植物榄李（lumnitzera racemosa）根泥样品中分离筛选出1株具有细胞毒活性的黑曲霉菌株ZHN2-20，提取分离其代谢产物，采用SRB法和MTT法评价了代谢产物对HeLa、A-549、MGC-803、HL-60、K-562这５种肿瘤细胞株的细胞毒活性，以阿霉素（Doxorubicin）作为阳性对照，观察实验结果可知，化合物（22E，24R）-ergosta-7,9(11),22-triene-3beta;,5alpha;,6beta;-triol和（22E，24R）-ergosta-7,9(11),22-triene-3beta;,5alpha;-diol对以上细胞株的增殖有一定的抑制活性[10]。
2.3抗菌作用：提取黑曲霉的次生代谢产物，对多种常见微生物进行实验，用常见抗菌药物作为对照。记录实验结果后分析可知，其抗菌效果十分显著，且对不同微生物的抑制程度不同，对孢子类真菌抑制作用最好[10-14]。
2.4对植物的次生代谢产物的调节作用：黑曲霉次生代谢产物可作为真菌诱导子，有提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的作用，且此作用随黑曲霉次生代谢产物浓度变化较大[15-16]；能有效提高甘草不定根中次生代谢产物的积累，但对甘草的生长有一定的抑制作用[17-18]。
三． 问题与展望
从目前对黑曲霉次生代谢产物的研究来看，有几个问题和思考:
3.1防治线虫方面：黑曲霉代谢产物的防治机理是增加植株本身对病害侵袭的抵御能力，那么黑曲霉能否作为一种有机肥料广泛使用呢？黑曲霉作为一种常用的细胞工厂，使用量十分巨大，工厂在获得目标产物的同时，将含有大量次生代谢产物的废弃部分转卖至农场，既能节约成本，又能提高资源利用率实现双赢。或者，黑曲霉次生代谢产物不仅仅能防治线虫，相关侵害原理的害虫防治是否都能起效？
3.2抗肿瘤活性方面：目前寻找抗肿瘤药物的希望基本在天然药物方面上，许多天然药物已经被证实具有抗肿瘤活性。但是，有活性并不代表能成功研制药物，活性的强弱，生产的成本等多种因素都需要考虑。黑曲霉次生代谢产物的优势在于真菌培育速度快，即使含量低也可以以量取胜，缺点在于提纯出药物可能成本极大。
3.3抗孢子类真菌方面：由于伟大的青霉素的发现，让我们开阔了思路，也意识到用传统方法难以解决的微生物感染可以用另外一种微生物解决。而真菌类疾病虽然很少有危及人类生命的情况，但十分难以根除且容易复发。因为感染微生物的人所处的环境中还有着大量此类微生物，重新感染的机率极大。微生物感染中还有多数会对人的外貌产生不好的影响，让人十分困扰。黑曲霉被FDA认定为GRAS级的安全微生物[11]，它的次生代谢产物有可能作用比较温和，能被大部分人接受，不至于出现青霉素类的严重过敏现象，有可能有用于日常微生物感染的预防药物的潜力。
参考文献
[1] 郭艳梅,郑平,孙际宾.黑曲霉作为细胞工厂[J].生物工程学报.2010(10)
[2] 姜薇，蒋航成，韦歆等.海洋真菌Aspergillus niger XJJ-3中萘并吡喃酮类化合物结构及生物活性[J].微生物学通报.2018(09)
[3] Akiyama Kohki, Teraguchi Seigo, Hamasaki Yukiko, et al. New Dimeric Naphthopyrones from Aspergillus niger[J]. Journal of natural products. 2003. 136-139
[4] Alain Simplice Leutou1, Keumja Yun, Byeng Wha Sonl. Induced production of 6,9-dibromoflavasperone, a new radical scavenging naphthopyranone in the marine-mudflat-derived fungus Aspergillus niger [J]. Archives of Pharmacal Research. 2016, 39(6):806-810.
[5] 张翼.两株海藻内生真菌次生代谢产物及其生物活性研究[D].山东:中国科学院大学(中国科学院海洋研究所).2007
[6] Yi Zhang, Song Wang, Xiao-Ming Li, et al. New Sphingolipids with a Previously Unreported 9-Methyl-C 20-sphingosine Moiety from a Marine Algous Endophytic Fungus Aspergillus niger EN-13.[J]. Lipids. 2007, 42(8):759-764.
[7] 关丽萍，周婷婷，李达翃等.海洋真菌黑曲霉2HL-M-8次级代谢产物的分离鉴定及抗肿瘤活性[J].中国药物化学杂志.2016(01)
[8] Song Shuang, Li Jing, Liu Lan. Secondary Metabolites of Aspergillus niger 102~# Isolated from a Anemone.[C].第十二届海洋药物学术年会.2015-10-26.
[9] 袁继承.两种植物和两种真菌的次生代谢产物研究[D]甘肃:兰州大学.2013
[10] 李颂,段玉玺,朱晓峰等.黑曲霉次生代谢产物对番茄抗根结线虫病效果的影响[J].中国蔬菜.2011(04)
[11] 孙世伟,付娟,周会楠等.红树林来源黑曲霉Aspergillus niger ZHN2-20次级代谢产物的研究[J].中国海洋药物.2014(06)
[12] 李祝,丛铭,刘松等.黑曲霉抗菌活性组分分离研究[J].食品安全质量检测学报.2014(12)
[13] 吕佳奇.嗜盐植物盐地碱蓬内生真菌黑曲霉中次生代谢产物研究[D]黑龙江:黑龙江中医药大学.2014
[14] Padhi Srichandan, Masi Marco, Panda Sujogya K, et al. Antimicrobial secondary metabolites of an endolichenic Aspergillus niger isolated from lichen thallus of Parmotrema ravum[J]. Natural product research.2019,1-8
[15] Subhankar Chatterjee, Yi Kuang, Richard Splivallo, et al. Interactions among filamentous fungi Aspergillus niger, Fusarium verticillioides and Clonostachys rosea: fungal biomass, diversity of secreted metabolites and fumonisin production[J]BMC Microbiology. 2016,16(1)
[16] Jomori Takahiro, Hara Yasumasa, Sasaoka Miho, et al. Mycobacterium smegmatis alters the production of secondary metabolites by marine-derived Aspergillus niger[J]. Journal of natural medicines. 2020,76-82.
[17] 曾杨.黑曲霉诱导子和水杨酸对虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的影响[D].四川:四川农业大学.2008
[18] 文涛.虎杖愈伤组织白藜芦醇次生代谢调控体系研究[D].四川:四川农业大学.2008
[19] 李静.甘草不定根的反应器培养及诱导子的作用研究[D].天津:天津大学.2016
[20] Jing Li, Juan Wang, Jinxin Li, et al. Aspergillus niger Enhance Bioactive Compounds Biosynthesis As Well As Expression of Functional Genes in Adventitious Roots of Glycyrrhiza uralensis Fisch[J]. Biochemistry and Biotechnology. 2016, 178 (3):576-59.
一、研究问题：黑曲霉次生代谢产物的化学结构及其药理活性。
二、研究手段：课题拟取黑曲霉标准菌株，在适宜环境下发酵，用超声破壁，有机溶剂萃取，柱色谱及薄层色谱等手段得到纯化合物，运用IR,NMR,MS等波谱技术分析化合物结构，并查阅相关文献全面深入地研究其生理活性。下图为简略实验流程：
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