蛋白质泛素化修饰组学研究的技术建立
研究背景
真核细胞的蛋白质大部分是翻译后修饰（PTMs）蛋白，泛素化修饰作为一种常见的修饰方式，在细胞周期、细胞凋亡、转录调控DNA修复以及信号转导等生理过程中起着关键作用。泛素是由76个氨基酸组成的多肽，高度保守，可通过异肽键与靶蛋白质的赖氨酸残基的ε氨基共价连接。泛素化蛋白含量低，且难以准确高效的鉴定，针对泛素化位点的抗体可对复杂样品进行特异性富集；质谱技术的应用，将实现大规模的蛋白质鉴定以及赖氨酸泛素化位点信息等。异常的蛋白质泛素化与人类许多疾病的发生发展密切相关，利用蛋白质组学技术对泛素化进行定性定量分析，有利于更深入了解蛋白质泛素化的生理功能与某些疾病的联系，帮助发现新的药物靶点。
选题目的
利用质谱技术对泛素化修饰肽段和蛋白的大规模鉴定，完善从样本处理到数据分析的实验流程，从鉴定数目和实验重复性等方面，针对不同类型的样本得到稳定的鉴定结果。
文献综述
近年来，蛋白质修饰组学研究取得了一系列进展，在蛋白质样品预处理、蛋白质定性定量分析以及数据解析等方面均有所突破。
- 高效样品处理技术
为了提高泛素化蛋白质在细胞中的含量，在裂解细胞前，用蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理细胞，由于硼替佐米的抑制，运输到蛋白酶体的蛋白质无法降解，那些参与高度生物活性过程如细胞周期调控、转录的蛋白质得以累积。在肽段富集前利用反相色谱将酶解肽段进行分离，以降低样本的复杂度。通过更有效的洗涤步骤减少抗体珠子的非特异性吸附1，提高diGly肽与无修饰肽的比率。
泛素化蛋白质/多肽样品含量低，其预处理主要基于抗体法2,3。Cell Signaling Technology(CST)的科学家于2005年首次发表PTMScan技术实现利用基序抗体(motif antibody)在肽段水平免疫富集酪氨酸磷酸化和下游的定量质谱分析4，这一专利蛋白质组实验方法可在进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析之前，使用PTM抗体和基序特异性抗体来富集含PTM的肽段。UbiScanreg;是PTMScan Discovery的子产品，用于研究泛素化蛋白质组。UbiScanreg;使用专有抗体来靶向胰蛋白酶消化后泛素的二甘氨酸残基(K-ε-GG)。此外，徐平团队5通过基因工程技术构建了串联杂合泛素结合结构域，从人高转移性肝癌细(MHCC 97H)中鉴定到3145个泛素化蛋白，其鉴定蛋白数目较前期文献提高了5倍以上。
- 高准确高覆盖的蛋白质定性与定量分析技术
在蛋白质组深度覆盖分析方面，3个国际小组先后于2004年和2005年Natur和Science杂志上公布了3张人类蛋白质组草图6-8，覆盖了人类基因编码蛋白质的85%。然而，由于蛋白质的低丰度和强疏水性等原因，仍有15%的基因编码蛋白质为漏检蛋白质。徐平团队9利用不同浓度制备的凝胶对不同相对分子质量蛋白质保留能力的不同，建立了4层凝胶过滤的方法，在蛋白质水平去除高丰度的高相对分子质量蛋白质，以富集低相对分子质量蛋白质;通过对低相对分子质量蛋白、膜蛋白、磷酸化蛋白及泛素化蛋白等4类蛋白质采取相应的特殊富集策略，总共鉴定到79种漏检蛋白。
- 蛋白质组分析数据解析新技术
在蛋白质组鉴定分析方面，贺思敏团队10开发了最新版蛋白质鉴定引擎pFind-Alioth，对高分辨率质谱数据进行快速和无限制数据库。Coon团队11开发了基于匹配离子数和离子强度的简单打分算法，对高精度质谱数据进行分析的软件Morpheus；可以得到比Mascot、OMSSA、Sequest等软件更多的蛋白质鉴定结果，并且速度比其它软件快1.5到4.6倍。
在蛋白质组定量分析方面，Cox团队12开发的MaxQuant软件，被广泛应用于蛋白质组无标记定量、基于一级谱的标记定量和等重标记定量。贺思敏团队13发展了通用蛋白质定量软件pQuant；与现在国际知名蛋白质组定量软件MaxQuant相比，pQuant在多组评测数据集上显示出明显优势。
研究内容
对泛素化修饰蛋白的大规模分析研究主要是利用可以特异性识别多肽中赖氨酸侧链ε氨基上的-GG标签的抗体，从而对泛素化修饰蛋白经胰酶水解后产生的带有-GG标签的肽段进行富集，再利用质谱技术对富集的修饰肽段进行分析。该分析策略将传统免疫分析技术的高度特异性和质谱技术的高度灵敏性、高分辨率等特性相结合，已经成为对复杂生物样品中的各种翻译后修饰的蛋白质进行定性、半定量、甚至定量的分析的主要手段。主要有以下几个实验步骤：
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