开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 研究背景及研究目的
截止2018年上半年，单抗药物在全球十大畅销药品排行榜上占据 7个席位，单抗药物在全球生物制药中所占市场份额从 2000 年的 10 %增长至当前的约 50%， 是现代生物制药行业中占比最大、增长最快的细分子行业。而全人源单抗更是具有免疫原性小、在体内半衰期长、作用特异性强等优点，从而被广泛应用于自身免疫性疾病、肿瘤等的治疗[5]。转基因小鼠技术和抗体库技术是生产全人源单抗使用的主要技术手段。其中抗体库技术不依赖于动物培养，操作方便且方法众多，获得诸多科学家和制药公司的认可。
全人源抗体的应用十分广泛，从经典的自身免疫性疾病以及肿瘤的治疗到传染病的诊断与治疗。最早的抗体库由噬菌体展示技术构建，所有的基因均为天然来源。随着抗体库技术的发展，一些天然序列能被人工合成序列所取代，进一步扩展了抗体库技术的应用范围，而更多的展示载体也为结构更为复杂的抗体表达提供了更大的平台[3]。
应用噬菌体展示技术建立的抗体库具有多种类型，包括单链抗体(scFv)库、抗原结合片段(Fab)库等。建立 Fab 库，常用的做法是将重链 V 区基因插入噬菌体 gⅢ蛋白基因中，将轻链 V 区基因转入宿主细菌中，通过宿主细菌表达后与已经表达在噬菌体表面的重链 V 区结合[7]。
本研究旨在建立构建全人源 Fab 噬菌体抗体库的技术平台，从未经主动免疫的成年健康人血液中分离淋巴细胞提取总 RNA 逆转录为 cDNA ，并以其作为初始模板，构建噬菌体抗体库。
- 文献综述
1、噬菌体抗体库
噬菌体展示技术是基于外源DNA片断能被插入到丝状噬菌体表达外壳蛋白(P3蛋白)的基因中，由此导致外源DNA片段所编码的氨基酸序列可与丝状噬菌体外壳蛋白一起以融合蛋白的形式表达并展现在噬菌体的表面。人们将带有这种融合蛋白的噬菌体称为融合噬菌体。噬菌体表面的Ig可被相应抗原选择性结合，利用靶分子(抗体、受体蛋白、抗原等)与表达在噬菌体表面的抗体、多肽或蛋白质进行特异性、非共价结合，采用效率高、特异性强的亲和筛选方法，可筛选获得目标融合噬菌体[1]。
噬菌体抗体库制备的基本程序是，（1）收集不同人群、足够量的淋巴细胞，提取DNA或提取mRNA并转录成cDNA。（2）设计模板，扩增DNA中的抗体可变区基因。用PCR方法直接将轻链和重链可变区基因组合在一起构建Fab，也可分别将携带轻链或重链的基因载体导入同一个菌体内。（3）把抗体可变区基因克隆到噬菌体外壳蛋白的基因中，通过噬菌体的主动侵染作用或联合使用电穿孔法，将含有抗体DNA片段的噬菌体转染大肠杆菌，构建重组噬菌体。（4）以目的抗原包被固相载体，以经扩增的噬菌体与固相抗原反应，通过洗涤获取阳性噬菌体，进一步扩增培养。（5）采用突变或链置换使亲和力成熟。
噬菌体抗体文库的优点是直接将可现的表达型与其基因型联系在一起，再利用其配体的特异性亲和力筛，将不同感兴趣的蛋白或多肽挑选出来。它相对于传统的筛选技术，在时间周期、抗体类型、筛选范围、经济成本等有较为突出的优势[4-5]。
通过噬菌体展示技术获得的抗体，不仅去除了鼠源抗体的免疫源性，而且免去了人源化操作，其筛选过程相对简单，高效，能在较短时间内获取亲和力较强的全人源抗体。随着分子生物学、肿瘤免疫学的不断发展和噬菌体抗体库技术的成熟，它必将成抗体生产的主要技术，将给人类的新药开发带来广阔的前景[2]。
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