研究课题及意义
重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究。重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力。从理论上来讲，获得重组蛋白的过程相当直接：获得目的基因，克隆到表达载体，转入表达宿主，诱导，纯化。然而，实际上，事情通常并不是这样。宿主菌生长差，包涵体的形成，蛋白无活性，甚至无法获得任何蛋白，这些都是实验中会遇到的问题。
毫无疑问，重组蛋白在微生物中的表达革新了生物化学领域。以前，纯化少量的目的蛋白需要处理几千克的动物或植物组织，或是大量的生物体液，这个时代已经一去不返了。而大肠杆菌在其中作为受体细胞得到了广泛的应用。利用大肠杆菌作为宿主具有很多优点。1.它有无可比拟的快速生长机制，在glucose-salts培养基中，以及在最优的环境条件下，它扩增一倍的时间大约是20分钟。这意味着以1/100接种的菌液在几个小时就可以生长至饱和。2.高浓度细胞培养物较容易实现。3.用一些廉价的成分，可以很容易的配制富营养的复合培养基。4 DNA的转化方便而且快捷。但同样的，我们面临着重组蛋白的表达可能对微生物体的造成代谢压力，导致菌体扩增大幅减慢等问题有待解决。因此，我们打算分析和改造大肠杆菌的基因组，使其可以更好地表达重组蛋白。
研究手段
本课题拟采用分析大肠杆菌基因组，敲除其生存非必要基因组，导入表达重组蛋白的质粒，根据重组蛋白表达效果，找到可以表达重组蛋白的最优大肠杆菌基因组。
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引物设计合成
选取合适引物，扩增目的基因，并与质粒重组。
2. PCR反应
扩增重组质粒，获得大量目的基因和突变目的片段。
3. 突变目的片段体外重组
将突变目的片段和野生型DNA片段与野生型质粒连接，转化，涂板，挑单菌落培养。通过菌PCR和测序鉴定构建是否成功。
4. 制备选定的大肠杆菌感受态 - 将重组质粒导入大肠杆菌感受态，构建重组大肠杆菌
- 根据基因组序列分析，敲除重组大肠杆菌基因组中非必要基因，表达重组蛋白
- 重复上一步骤，找到最优化大肠杆菌基因组
- 实习期间详细记录实验数据，撰写毕业论文，为今后发表文章积累数据
文献综述
基于重组蛋白表达的大肠杆菌基因组的分析和改造
高瑛
摘要：大肠杆菌(Escherichia coli) 是在分子水平上研究最清楚的模式生物，且由于生长快速，遗传操作简单，在基础研究和工业应用上有着其他模式生物无可比拟的优势。然而，天然的大肠杆菌的基因组包含很多对生存非必需的基因、转座元件、噬菌体 DNA、前噬菌体、毒力因子、假基因和基因残余等。去除这些生存非必需的区域将有利于降低大肠杆菌基因组的复杂度，增强其可预测和调性；而且去除了生存非必需的代谢途径可以提高细胞对目标生物产品的转化效率，使其成为理想的研究与应用的底盘生物。
关键词：重组蛋白 基因敲除 必需基因 规律成簇间隔短回文重复（CRISPRs）
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