实验背景：蛋白酶( protease)是催化肽键水解的一类酶, 广泛存在于动物、植物和微生物中, 执行许多不同的生理功能。蛋白酶种类的多样性和水解活性的专一性, 使其在食品、皮革、洗涤剂等工业生产领域成为具有重要商业价值的工业用酶, 据估计当前世界工业生产酶市值10亿美元, 蛋白酶为工业生产酶三大类之一, 其约占总市值60% 。利用不同的蛋白酶或相关的产酶微生物可以制备各种活性多肽。有关研究表明, 利用蛋白酶水解大豆蛋白(或是直接用微生物发酵)获得的大豆多肽能够有效抑制血管紧张素转换酶( Angiotens in converting enzym e, ACE) 的活性, 同时可以获得酪蛋白磷酸肽( Case in phosphopeptides, CPPs)、玉米肽等对人体非常有价值的活性多肽。蛋白酶是一类广泛应用于食品'纺织'医药'有机合成'洗涤剂及制革脱毛等方面的重要工业和研究用酶，其份额占整个酶制剂市场的一半以上，最大的用途是洗涤剂，其次用于饲料'食品工业'以及制革工业。蛋白酶既可以从动植物组织中提取，也可以通过微生物发酵工艺进行生产。目前生产蛋白酶制剂主要利用曲霉，芽孢杆菌等微生物发酵制备。随着蛋白酶应用的日趋广泛和需求的日益增多，分离筛选能分泌具有良好酶学特性并适用大规模工业生产的蛋白酶高产菌株，是广大科研人员的研究目标和任务。
实验目的：结合透明圈法和福林酚试剂法从老师准备好的16株枯草芽孢杆菌中筛选出产蛋白酶活性较高的五株，再采用芽孢染色法和生物学鉴定方法鉴定其特性。拟为具有高蛋白酶活性饲料添加剂的研发提供参考菌株。
实验步骤：1，产蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选分离
先将老师给的16株枯草芽孢杆菌接种到肉汤斜面培养基上，30℃恒温培养箱中培养24h活化，再将菌种接种到肉汤液体培养中，30℃恒温培养箱中培养24h。配置好脱脂牛奶固体培养基，将菌种从液体培养基中涂布到筛选平板中，倒置于30℃恒温培养箱中培养24h。观察平板上菌落周围的透明圈，并计算出（H/C）比值，标号做好记录。将涂布平板中具有透明圈的菌落在脱脂牛奶平板上进行划线分离纯化。最后将分离出的单菌落接种到斜面培养基中，于30℃恒温培养箱中培养24h后，放入冰箱中4℃保藏。
2，L-酪氨酸标准曲线的绘制
分别取上述溶液各1.0mL( 须做平行试验) ，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00mL后，再加入福林=酚试剂1.00mL，摇匀置于40plusmn;0.2℃水浴锅中显色20min后，用分光光度计于波长 680nm比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程#计算出当OD为1时的酪氨酸的量(mu;g) ，即为吸光常数K值，其K值应在95-100范围内.
3，中性蛋白酶活性的测定
筛选出的菌株，活化接种子液后，以3％（V/V）的接种量接入发酵培养基（100mL/250mL）,37℃，170r/min培养48h。按照国标福林-酚试剂法测定出这几株菌发酵液中性蛋白酶活性，比较这几株菌发酵液中性蛋白酶活性大小。
4，鉴定细菌
- 菌落形态鉴定
鉴定在营养琼脂平板上生长24h 后菌落的形状、大小、干湿、颜色、边缘、表面、透明度。
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