一、背景介绍：
脱落酸(abscisic acid，ABA)是以异戊二烯为基本单位的一种15碳的类倍半萜类植物激素，因能促进叶脱落而得名。它存在于高等植物的器官和组织中，尤其在成熟、衰老组织或处于休眠的器官中含量丰富， 是植物5 大类天然生长调节物质之一, 在农业生产方面显示出广阔的应用前景[ 1- 2] 。ABA在植物体内具有多重功能。ABA最显著的作用是调控植物生长发育和植物对非生物胁迫应答中的反应，如种子萌发、营养生长、芽休眠、气孔运动、胚胎成熟、叶片衰老[3]、盐胁迫、低温胁迫、渗透胁迫[4-6]。随着研究的逐步深入，近年来发现ABA在植物对病原菌的防御中起着重要的调控作用[7-11]。
由于植物体中脱落酸含量极低，直接从中提取可行性不大。人工合成的外消旋型脱落酸是天然型和非天然型脱落酸的混合物，不仅价格昂贵，而且生理活性低[12] 。因此， 脱落酸是惟一未被广泛应用于农业生产的天然植物生长调节物质。 近年来， 利用微生物发酵生产脱落酸受到关注。研究发现，某些真菌发酵产生的脱落酸具有纯度高、生理活性强等优点，微生物发酵法成为公认的具有广阔发展前景的脱落酸生产方法[13-15] 。
微生物发酵过程机理复杂，影响因素多，对微生物发酵工艺进行优化显得尤为重要，并已成为发酵水平高低的决定因素之一，相关的研究报道也越来越多［16－18］。同时，许多试验技术和设计方法在微生物发酵工艺优化中得到应用［19－20］。传统的优化试验方法有单因素法、正交设计法等，当考察的因子较多以及因素之间存在交互作用时，试验次数会大幅增加，甚至导致试验结果不准确［21］。而很多方法即使减少了试验次数，却未能给出直观的图形，不能凭直觉观察其最优点。有的虽能找出最优值，但难以直观地判别优化区域。由Bxo 和Willsno 最早提出，后经Hill和Htlnetr进一步完善的响应曲面法( Response Surface Method，RSM) 在微生物发酵工艺优化研究中成功克服了传统方法的缺点，取得了良好效果［22］。RSM 作为一种适用性很强的试验设计方法，不仅包括试验设计、建模、因子效应评估以及寻求因子水平最佳操作条件等功能，而且具有数据统计处理功能，是一种简易、迅速、可靠的统计学优化方法［23］。
微生物发酵补料工艺优化随着发酵的进行，菌体量快速增加，营养不断下降，有害代谢产物增多，高浓度底物抑制愈发明显。为了解决这些问题，补料分批发酵已被广泛应用。针对补料工艺中应采取何种流加方式，即何时补加、补加的量和补加时间间隔等，亦可利用RSM 法对其进行优化，寻求最适合的方式。常用的微生物培养工艺有：分批培养、分批补料培养、半连续培养、连续培养等，鉴于本实验中的目的产物属于次生代谢产物，因此主要研究分批补料培养的相关工艺优化。根据不同的因素可以分为：C源补料与N源补料、变体积补料、定体积补料、循环分批补料培养等方式。而次级代谢产物, 多在稳定期中合成，可通过缩短对数生长期、延长稳定期或降低对数生长期的生长速率，从而使次级代谢产物更早形成，达到提高发酵效率的目的。
而在真菌中，ABA生物合成途径主要在次级代谢过程中产生，这些真菌中蔷薇尾孢霉，豆类煤污尾孢霉及灰葡萄孢霉等常用来研究ABA的生物合成。本次实验主要采用本实验室选育诱导保存的灰葡萄孢霉菌。
前期已经对灰葡萄孢霉菌发酵产ABA的作用进行了一些实验研究。通过紫外和化学诱变的方法［24］得到相对高产的菌株Botrytic cinerea L-13，并针对其固体发酵的相关条件进行了探索，而后又进行了其液体发酵所用培养基成分的选择实验，用Placket t-burman法筛选影响产量的察葡萄糖、CaCO3、VB1 等八个因素，又通过球面对称设计研究了影响较大的三个因素: 葡萄糖、谷氨酸单钠、玉米粉，从而筛选出最佳发酵培养基［25-26］。而后对其代谢过程的关键酶的进行了研究，并通过对类胡萝卜素[27]以及钼酸盐的作用效果进行实验，使ABA的产量以及菌体生长状况都得到了很大改善。
本实验计划通过实验验证与计算机软件预测处理结合的方法对脱落酸液体发酵环境及工艺进行研究，通过实验软件工具Design-Expert 进行响应面曲线（RSM）设计方法进行实验设计及预测，RSM 的设计方法有很多，其中最经典的设计方法是Box-Behnken设计( Box-Behnken Design，BBD) 和中心组合设计( Central Composite Design，CCD），本次实验采用了中心组合设计这一方法，通过对预测的模组进行实际实验进行验证，从而拟合出相符的数学模型进行各个因素的处理。之后通过对间歇发酵和补料发酵方式的动力学过程研究，运用MATLAB等工具进行数据处理，拟合数学模型从而得到优化结果。
二、拟研究的问题：
1. 对脱落酸液体发酵条件进行优化，具体通过CCD的设计方法进行实验，并对结果
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