基于Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用的小分子调控剂研究文献综述

 2023-02-20 19:12:28

外来化合物代谢或病理过程中产生的活性亲核物质直接或间接干扰DNA、蛋白质和脂质等生物大分子的生理功能,对各种疾病包括肿瘤、神经退行性疾病、动脉粥样硬化和老化的病理形成等起重要作用。为了对抗外来袭击,细胞在进化过程中已经获得防御这些毒性作用的复杂机制,如一组编码解毒酶和抗氧化应激蛋白的基因在暴露于亲核物质和活性氧(ROS)后被协同诱导[1,2]。这种协同诱导反应通过靶基因调控区称为抗氧化反应元件(ARE)或亲核反应元件(EpRE)的顺式作用元件调控[3,4]。最近研究表明,转录因子NF_E2相关因子2(Nrf2)和它的细胞质接头蛋白Keap1是细胞抗氧化反应的中枢调节者。实验证明,Nrf2通过与ARE相互作用调节编码抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达。大量的研究发现Keap1-Nrf2 ARE通路在诸如抗肿瘤、神经保护、抗炎症反应等方面具有广泛的细胞保护功能。

近年来的抗氧化损伤研究表明,Nrf2在抗氧化损伤中起关键作用,能维持细胞内氧化还原平衡,使细胞免受损伤。同时,当前的研究主要集中于抗氧化基因的转录诱导,而这也是关键的一步,抗氧化蛋白可以清除过多的由于氧化还原失衡而增加的自由基,同时也能清除被氧化的蛋白。但是Nrf2的持续激活,也会产生不利的后果如癌症,动脉硬化等。而且多种疾病如糖尿病、风湿性关节炎、神经退行性疾病等均伴随着氧化应激损伤,可以观察到Nrf2活性和抗氧化蛋白活性的改变,对于在这些疾病中Nrf2的作用机制仍未阐明。随着研究的深入,Keap1-Nrf2-ARE通路将可能作为一个有效的作用靶点,为治疗相关疾病提供新的治疗方案。

这个途径有三个主要组件,elch-like,ECH-associated蛋白1(Keap1),核转录因子红细胞两个相关因子2(Nrf2)和抗氧化反应元素(ARE)。转录因子Nrf2是一种含CNC结构域和碱性亮氨酸拉链(Bzip)结构的蛋白,它介导100多个氧化应激基因,在这些基因的启动子调控区域中含有增强子序(5-GTGACnnnGC-3)。

Keap1是一种富含半胱氨酸的蛋白质(人体的Keap1由626个氨基酸组成,其中含有27个半胱氨酸),它是内源性的Nrf2抑制剂。在正常的生理条件下,Nrf2被隔离在胞质中并通过Keap1-dependent泛素化和蛋白酶体降解而保持较低在较低的水平。在氧化应激反应中如活性氧(ROS)亲电子化学物质,Keap1通过其活性半胱氨酸作为氧化还原的传感器。半胱氨酸的共价修饰导致Keap1的构象变化最终导致缓解Nrf2 Keap1-directed退化。总之,Keap1 -Nrf2 -氧化还原信号通路可以调节维持细胞内稳态状态的细胞,因此在对癌症、神经退行性疾病、心血管疾病、代谢和炎症性疾病等与氧化应激和细胞内稳态的有关的疾病的预防和治疗中,Keap1 -Nrf2已经成为一个很有吸引力的靶细胞。最著名的调节器是Reata pharmaceuticals公司研制的三萜CDDO-methyl 酯(bardoxolone methyl),以及由生物基因艾迪克公司研发的富马酸二甲酯和二甲基甲基延胡索酸酯。

Keap1/Nrf2/ARE 信号通路概述

核转录因子红细胞系 -2p45(NF-E2) 相关因子 -2 (nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2),分子量为 66 kDa,是一种 CNC (cap-n-collar) 家族的核转录因子,含有一高度保守的碱性亮氨酸拉链 (basic region-leucine zipper, bZIP) 结构。Itoh 等根据 Nrf2 保守序列,将 Nrf2 分为 6 个功能域,分别被命名为 Neh1Neh6 (Nrf2-ECH homology)。Neh1包含 bZIP DNA 区域,这是一个 DNA 绑定和异源二聚化作用的区域,能与小分子肌腱纤维瘤蛋白(muscloaponeurotic fibrosarcoma protein, Maf ) 形成异源二聚体结合到 DNA 上。Neh2 包含了两个重要的保守区域 DLG 和 ETGE,是与 KEAP1 蛋白相互作用而被锚定于细胞质中的位点。Neh3位 于 C 端, 可 与 CHD6 (a chromo-ATPase/helicase DNA binding protein) 绑定,从而促进抗氧化反应元件 (antioxidant response element, ARE) 调控相关基因的转录。Neh4 和 Neh5 两个区域一起可以与 CBP(cAMP response element (CREB) binding protein) 蛋白相互作用,起到转录活化的作用。Neh6 区域富含丝氨酸,是非 KEAP1 依赖的 Nrf2 降解的调控区域。Wang 等最近发现新功能域 Neh7, 是与视黄醇类受体 (retinoid X receptor alpha, RXRalpha;) 相互作用的区域。ARE 是一种顺式作用元件,其序列为 5-(G/A)TGA(G/C)nnnGC(G/A)-3 (n 代表任何种类核苷酸 ),是在 Nrf2 发现之前由 Cecil Pickett 和 Violet Daniel 实验室在研究编码谷胱甘肽巯基转移酶启动子时发现的。以 Nrf2- 敲除小鼠为工具且基于微阵列分析研究发现 Nrf2 调控二百多种基因的表达,其中许多基因都用于编码解毒、抗氧化和谷胱甘肽生物合成酶等。根据其细胞保护的作用,这些 Nrf2 通过 ARE 调控的靶基因可划分为两类 :(1) 与内源或外源物质代谢与转运相关,包括 NAD(P)H: 醌氧化还原酶 (NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1, NQO1)、醛固酮还原酶 (aldo-keto reductases, AKRs)、尿苷二磷酸葡醛酸基转移酶(UDP-glucuronosyl transferases, UGTs) 以及谷胱甘肽硫基转移酶 (glutathione-S-transferses, GSTs) 等 ;(2)与抗氧化功能相关,包括具备抗氧化功能的蛋白,主要有谷氨酰半胱氨酸连接酶 (glutamate cysteine ligase catalytic, GCLC) 以及血红素加氧酶 1 (haem oxygenase-1, HMOX1) 等。

Nrf2激动剂筛选方法

因 Nrf2 和靶基因启动子上 ARE 特异性结合,ARE-报告基因的方法近年来被许多实验室采用。Wang 等利用乳腺癌 MCF7 细胞建立了一稳定表达 ARE- 荧光素酶 (luciferase,luc) 细胞株,命名为 AREc32。此细胞株 ARE-荧光素酶的活性主要受 Nrf2 调控,其诱导性和 Nrf2 内源靶基因相似。基于 AREc32 的 ARE- 报告基因方法不仅反应快、操作简单、灵敏度高 , 而且能区别激动剂之间药效的差别,是高通量筛选药效高的小分子激动剂的有效生物学方法。通过类似方法 Zhu 等在肝癌细胞 HepG2 中建立了 ARE-GFP 报告基因的方 法 ;Hur 等在 neuroblastoma IMR-32 cells 中建立了 hNQO1-ARE-luc 报告基因的方法 ;Pandey等利用呼吸道表皮细胞 Beas-2B 建立 NQO1-ARE luciferase 报告基因的方法。Smirnova 等利用 NRF2 的功能域 Neh2 可以和 KEAP1 相互作用的特点,建立了表达融合蛋白 Neh2-luc 的细胞株,此体系的优点是可以快速检测到 KEAP1 和 Nrf2之 间 的 相 互 作 用。Xie 等利 用 Nrf2/MafK 和NRF2/RunX2 相互作用的特性,建立了荧光素酶片段互补法 (Enzyme fragment complementation (EFC) method), 即于细胞内表达了 luc 部分片段和 Nrf2 融合蛋白,同时表达 luc 互补片段和 Maf 或 RunX2 融合蛋白。当 Nrf2 被激活,两种融合蛋白共同结合于 ARE 时荧光素酶才显示活性。最近质谱测量法和虚拟筛选方法也建立并用于高通量筛选 Nrf2 小分子激活剂。

小分子化合物干预 Nrf2/ARE 信号通路具有两种潜在后果 :一方面对于健康机体,Nrf2 激动剂通过瞬时上调 Nrf2 信号通路 , 启动细胞保护机制 ;另一方面对于肿瘤细胞,Nrf2 抑制剂通过中断 Nrf2信号通路增加化疗敏感性。鉴于肿瘤对 Nrf2/ARE通路的依赖性,而目前尚无 Nrf2 抑制剂进入临床,因此发现 Nrf2 新抑制剂是此领域发展趋势。继Nrf2 双重降解机制之后,Nrf2 的新功能域 Neh7 的发现将有利于发现探索抑制 Nrf2 信号通路新的治疗靶点。

引用文献

剩余内容已隐藏,您需要先支付 10元 才能查看该篇文章全部内容!立即支付

以上是毕业论文开题文献,课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。