开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
1 立题依据
微生物在环境变化过程中的反应能力对于其在自然环境下的生存至关重要,因为其可能经常处于热或冷、极端 pH、渗透压改变、营养饥饿和有毒化合物的极端环境下。抗逆环境是一般微生物不能适应和生存的环境,如强酸、强碱、高盐、高温、强辐射、紫外、干旱、高渗等环境。随着石油、煤炭等能源的极度消耗以及环境污染日益严重，生物技术在医药、农业、精细化工和能源等领域的应用得到了人们极大的关注。因此,构建适应工业化要求的微生物细胞工厂具有重要的现实意义。在生物能源和生物催化等应用领域，微生物宿主细胞的耐受性极为重要,研究微生物的抗逆性,有利于人们了解微生物的抗逆本质并控制和利用它们,在多个领域均有广阔的应用前景。
微生物细胞的溶剂耐受性是一个多基因-多系统参与调控的复杂过程。近年来,我们通过各种基因组学工具(以DNA微阵列为基础的转录组学分析、蛋白组学分析以及代谢组学分析),探究了细胞在不同溶剂或其他化学物质作用下的一系列应答机制。大致有以下几种：(1)诱导激活胞内压力应激系统。例如很大程度上依赖于分子伴侣功能的热休克反应系统(Heat shock protein, Hsp),在溶剂刺激下胞内存在的一些分子伴侣蛋白能够阻止溶剂导致的蛋白聚集，修复受损蛋白并辅助其进行正确折叠。(2)细胞膜组成成分的改变。微生物细胞膜脂肪酸含量的调控不仅对维持细胞膜的完整性具有重要作用，而且还维护了与膜相关的蛋白质和辅因子的正常功能。细胞通过对膜磷脂双分子层中脂肪酸的修饰,改变细胞膜的组成,维持稳定的细胞膜结构,抵御溶剂的渗入,从而提高细胞对于溶剂的耐受性。（3)启动物质运输和解毒系统。在溶剂压力下,细胞会倾向于通过双组份调控系统(TCS)提高胞内某些转运蛋白以及外排泵蛋白的表达量,使得溶剂或化学物质能及时降解运输至胞外,有效的降低其在胞内的残留量,从而降低溶剂对细胞的毒害作用。(4)调控能量的产生和合理的利用。通常在溶剂压力下,细胞能够调节胞内一些与呼吸功能以及三羧酸循环相关蛋白的含量,通过合理地调控代谢路径,完成胞内各个区域能量的均衡供给以度过“难关”。(5)压力应激途径的激活与调控等。例如在大肠杆菌中,主要存在五种细胞膜压力应答途径,分别为Bae, Cpx, Psp, Rcs和delta;E途径。研究报道显示,这些应答途径可以通过改变周质以及外膜蛋白的组成,从而使细胞更好地适应外界恶劣的环境。(6)其他有机溶剂耐受性机制。例如,微生物可以通过控制胞内胆固醇的合成以及细胞形态特征(拉伸)等,从而降低溶剂的进入和对细胞的毒害作用。
近年来,提高菌株的耐受性成为人们的研究热点,广泛用于提高耐受性的方法为过表达微生物耐性相关基因如溶剂外排泵和热休克蛋白等相关内源或外基因、长期适应性进化、人工诱变或基因组改组等以提高微生物对药物、渗透压等各种压力条件的耐受性。随着后基因组时代的发展,众多研究者更多地采用代谢工程手段以及从基因组全局水平出发研究微生物表型与基因组转录之间的关系。有研究报道通过对全局转录因子CRP进行随机突变得到能够耐受体积分数1.2%丁醇的大肠杆菌。 Hong 等对大肠杆菌全局转录因子 Hha 突变来调控生物被膜的形成,从而降低微生物的致病性；Borden等通过在丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824 中过表达转录调节因子 CAC1869,发现菌株的丁醇耐受性提高了 81%；Okochi等通过对全局转录调节子的研究，发现cyaA (adenylate cyclase)基因的敲除能够提高细胞的溶剂耐受性，并且敲除菌的耐受性受到外源CAMP的影响；Fiocco 等通过过表达热激蛋白(sHSP)改善了胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的抗寒性，同时发现菌株对乙醇和丁醇的耐受性也得到提高；Alper 等通过过delta;因子的全局转录调控工程(delta;70 )因子的全局转录调控工程,使大肠杆菌对乙醇的耐受质量浓度高达60g/L,并且能够同时耐受十二烷基磺酸钠(SDS)。
2 研究内容
本课题拟发酵已构建成功的dtd敲除菌株,检测其在不同浓度氯仿、乙醇、丙酮和DMSO等有机溶剂中的生长曲线,利用生物信息学分析dtd互作基因,qPCR定量检测基因变化,从而可以初步阐明dtd敲除菌的抗逆机制。
2.1大肠杆菌dtd敲除菌的耐碱活性测定：按千分之一接种量分别接种野生型大肠杆菌DH10B及dtd基因敲除菌（△dtd）于5ml LB试管培养基（pH 7.0）中,恒温摇床中37℃、220rpm培养3h,菌株生长OD600至0.5；利用LB培养基（pH 7.0）稀释DH10B及△dtd菌株OD600至0.1,然后再通过LB培养基将菌株稀释500倍；取250micro;l不同酸性LB培养基（pH 8、8.5、9、9.5、10）加入24孔板中（复孔数为3）,之后野生型及敲除菌株各取250micro;l菌液分别加入不同酸性孔板中；加样后24孔板置于37℃恒温摇床中,220rpm过夜培养18h,取出测定OD600。
2.2大肠杆菌dtd敲除菌的有机溶剂耐受测定：按千分之一接种量分别接种野生型大肠杆菌DH10B及dtd基因敲除菌（△dtd）于5ml LB试管培养基（pH 7.0，Nacl 10g/L）中，恒温摇床中37℃、220rpm培养3h，菌株生长OD600至0.5；利用LB培养基（pH 7.0）稀释DH10B及△dtd菌株OD600至0.1，然后再通过LB培养基将菌株稀释500倍（加入10micro;l菌液，加入5mlLB培养液）；之后野生型及敲除菌株各取250micro;l菌液分别接种在加入一定体积的氯仿、乙醇、丙酮、DMSO的培养基的LB培养基中，检测菌株生长状况，确定潜在的抗逆功能。
2.3解析抗逆活性相关基因：利用STRING（Version11.0）和结合已有的转录组检测数据,分析大肠杆菌不同菌株中dtd可能相互调控的基因。
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